PCTI 210. Respuesta inmune en leucocitos del bazo de Totoaba macdonaldi por efecto del β-glucano de Cystobasidium benthicum (βG-Cyben)

PCTI 210
Carlos Angulo
Autor de Correspondencia
Dr. Héctor Nolasco Soria
Editor
22/06/2022
Fecha de Aprobación
Biotecnología y Ciencias Agropecuarias
Categoría

Autores

Cristian Machuca1, Carlos Angulo1*, Yuniel Méndez-Martínez2, Martha Reyes-Becerril1, Miriam Angulo1, Verónica Sánchez1

1Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. (CIBNOR)-Grupo de Inmunología y Vacunología. eangulo@cibnor.mx

2Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ), Facultad de Ciencias Pecuarias y Biológicas, Ecuador.

Los inmunoestimulantes han ido reemplazando a los antibióticos, por los impactos y problemas que genera su uso, en la producción de peces.

Abstract

The β-glucan from the yeast Cystobasidium benthicum (βG-Cyben) can activate the defense system and could be used to improve fish production. Therefore, the immune response generated by βG-Cyben was evaluated in spleen leukocytes from totoaba (Totoaba macdonaldi). At the laboratory level, C. benthicum strain LR192 was used to extract βG-cyben and three concentrations (50, 100 and 200 μg/mL) were analyzed in spleen leukocytes from totoaba. The safety of the molecule and innate responses; phagocytosis, nitric oxide, respiratory burst and superoxide dismutase were evaluated. The results demonstrated that βG-cyben proved to be a safe molecule and to be a potential immunostimulant for T. macdonaldi because increased immune parameters, mainly dependending of the concentration.

Key words: phagocytic cells, yeast, immune system,

Resumen

El β-glucano de la levadura Cystobasidium benthicum (βG-Cyben) puede activar el sistema de defensa y podría ser empleado en la mejora de la producción piscícola. Por ello, la respuesta inmune generada por βG-Cyben se evaluó en leucocitos de la totoaba (Totoaba macdonaldi). A nivel laboratorio, se cultivó C. benthicum LR192 para extraer βG-cyben y se analizaron tres concentraciones (50, 100 y 200 μg/mL) en leucocitos del bazo de totoaba. Se evaluó la seguridad de la molécula y las respuestas innatas; fagocitosis, óxido nítrico, explosión respiratoria y superóxido dismutasa. Los resultados demostraron que βG-cyben es una molécula segura y un potencial inmunoestimulante para T. macdonaldi porque aumentó parámetros inmunes, principalmente dependiendo de la concentración.

Palabras clave: células fagocíticas, levadura, sistema inmune

Problemática

Existe poca información sobre el uso de productos de levaduras y de su beneficio en la mejorara de la salud y la producción sustentable de peces, como la totoaba.

Usuarios

La Secretaría de Agricultura y Desarrollo Rural (SADER), las secretarías de desarrollo estatal y municipal, los productores acuícolas y la sociedad en general.

Proyecto

Introducción

En los últimos años, los inmunoestimulantes han ido reemplazando a los antibióticos por los impactos y problemas que generan en la producción de peces (Vásquez-Piñeros et al., 2012). Los inmunoestimulantes de origen natural incrementan la resistencia a enfermedades por la activación de la primera línea de defensa (inmune innata). Como los β-glucanos obtenidos de la pared celular de levaduras presentan actividades que mejoran la salud de peces (Miest et al., 2016). Para el β-glucano de la levadura Cystobasidium benthicum se ha descrito su posible uso en organismos como peces (Reyes-Becerril et al., 2021) e incluso humanos (Sanchez et al., 2021). Por lo tanto, este estudio evaluó la respuesta de defensa inmunes innatas generadas por el β-glucano de C. benthicum (βG-Cyben) en leucocitos del bazo de un pez emblemático del Golfo de California: la Totoaba macdonaldi.

Objetivo:

Evaluar la respuesta inmune generada por βG-Cyben en leucocitos del bazo de la totoaba.

Materiales y métodos

Obtención de βG-cyben: La levadura Cystobasidium benthicum LR192 se cultivó en el laboratorio para extraer el β-glucano usando: soluciones alcalinas (para separar la pared celular), soluciones ácidas (para eliminar grasas y proteínas), y etanol (para purificar el glucano), siguiendo la metodología descrita por Sánchez et al. (2021).

Aislamiento y estimulación de leucocitos: Los bazos de totoabas fueron donados por Earth Ocean Farms, La Paz, Baja California Sur, México. Los leucocitos se aislaron del bazo mediante técnicas estandarizadas (Reyes-Becerril et al., 2016); y se concentraron hasta obtener 1 millón de leucocitos por mililitro. Enseguida, se agregaron diferentes dosis de βG-cyben (50, 100 y 200 μg/mL de medio de cultivo celular) y se incubaron durante 24 horas a 25 °C (Machuca, 2021).

Análisis de respuestas de defensa: Primero, se analizó el número de células vivas (viabilidad) para verificar que βG-Cyben no causaba daño. Otros parámetros como la habilidad fagocítica, la actividad de explosión respiratoria, producción de óxido nítrico y la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) fueron medidos con técnicas estándar de laboratorio descritas y citadas por Machuca, (2021).

Resultados y discusión

El βG-Cyben tiene una proporción de 53.4 % de enlaces β-1,3–1,6-glucano y un peso molecular de 2.32 kDa. Se observó que las tres concentraciones de βG-Cyben no fueron tóxicas para los leucocitos del bazo de totoaba (Fig. 1) como reportaron Reyes-Becerril et al. (2021) en células del timo de T. macdonaldi.

Figura 1. Viabilidad de leucocitos de bazo de Totoaba macdonaldi a las 24 h de estimulación con βG-cyben (50, 100 y 200 μg/mL). Las barras representan la media ± desviación estándar y las letras indican las diferencias significativas (p < 0.05) entre tratamientos. DMSO: Control de muerte celular (tóxico).

 

Los resultados indicaron que la concentración de 50 μg/mL de βG-Cyben (Fig. 2) es suficiente para activar la habilidad fagocítica, mecanismo de destrucción de patógenos por reacciones oxidativas realizado por los fagocitos (macrófagos y granulocitos). Este proceso y todas las actividades inmunes generadas por la estimulación de β-glucanos se origina en el reconocimiento de receptores transmembranales de tipo Toll y lectinas de tipo C (Pietretti et al., 2013). Este mismo efecto lo reportaron Callol et al. (2013) en leucocitos de la anguila europea (Anguilla anguilla) estimulados con 10 μg/mL del β-glucano comercial (Zymosan) obtenido de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La producción del compuesto oxidativo y tóxico (óxido nítrico) para patógenos se presentó en leucocitos de bazo a medida que se aumentó la concentración de βG-cyben (Fig. 3).

 

Figura 2. Células fagocíticas de bazo de Totoaba macdonaldi a las 24 h de estimulación con βG-cyben (50, 100 y 200 μg/mL). Las barras representan la media ± desviación estándar y las letras indican las diferencias significativas (p < 0.05) entre tratamientos.

 

Figura 3. Producción de óxido nítrico (estimada por la concentración de nitritos) en leucocitos de bazo de Totoaba macdonaldi a las 24 h de estimulación con βG-cyben (50, 100 y 200 μg/mL). Las barras representan la media ± desviación estándar y las letras indican las diferencias significativas (p < 0.05) entre tratamientos.

 

Este efecto también se encontró en células del timo de totoaba estimuladas con βG-cyben (Reyes-Becerril et al., 2021). El proceso de generación de especies reactivas de oxígeno (eROS) para la producción de compuestos tóxicos, también conocido como explosión respiratoria se dio con la concentración de 200 μg/mL de βG-Cyben (Fig. 4).

Figura 4. Actividad de explosión respiratoria en leucocitos de bazo de Totoaba macdonaldi a las 24 h de estimulación con βG-cyben (50, 100 y 200 μg/mL). Las barras representan la media ± desviación estándar y las letras indican las diferencias significativas (p < 0.05) entre tratamientos.

 

Este mismo efecto lo observó Vera-Jimenez et al. (2013) en leucocitos de la Carpa (Cyprinus carpio) con la concentración de 100 μg/mL de β-glucano comercial de S. cerevisiae (MacroGard). Como se producen especies tóxicas de oxígeno que pueden dañar las células del pez por estrés (Godahewa et al., 2015); entonces, para evitarlo, los leucocitos producen la enzima superóxido dismutasa (SOD) que tiene actividad antioxidante (Atli et al., 2016). En este trabajo, la actividad de SOD en leucocitos de totoaba aumentó a medida que se incrementó la concentración de βG-cyben (Fig. 5), sugiriendo una posible protección antioxidante.

Figura 5. Actividad de superóxido dismutasa (SOD) en leucocitos de bazo de Totoaba macdonaldi a las 24 h de estimulación con βG-cyben (50, 100 y 200 μg/mL). Las barras representan la media ± desviación estándar y las letras indican las diferencias significativas (p < 0.05) entre tratamientos.

 

Conclusiones

El βG-cyben estimuló las actividades de defensa inmune analizadas en leucocitos, por lo que se sugiere su evaluación como inmunoestimulante para el cultivo de la totoaba.

Impacto Socioeconómico

El objetivo de usar inmunoestimulantes es mejorar la salud de los peces; y más aún si es una especie marina en peligro crítico extinción con los más altos índices de crecimiento acuícola. Además, este aporte científico contribuye con información sobre el conocimiento del sistema inmune de esta especie tan importante para los Estados que colindan con el Golfo de California, y en general, en el país.

 

Referencias

Atli, G., Canli, E. G., Eroglu, A., & Canli, M. (2016). Characterization of antioxidant system parameters in four freshwater fish species. Ecotoxicology and Environmental Safety, 126, 30-37. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.ecoenv.2015.12.012

Callol, A., Roher, N., Amaro, C., & MacKenzie, S. (2013). Characterization of PAMP/PRR interactions in European eel (Anguilla anguilla) macrophage-like primary cell cultures. Fish & shellfish immunology, 35(4), 1216-1223. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.fsi.2013.07.037

Godahewa, G., Kim, Y., Dananjaya, S., Jayasooriya, R., Noh, J. K., Lee, J., & De Zoysa, M. (2015). Mitochondrial peroxiredoxin 3 (Prx3) from rock bream (Oplegnathus fasciatus): Immune responses and role of recombinant Prx3 in protecting cells from hydrogen peroxide induced oxidative stress. Fish & shellfish immunology, 43(1), 131-141. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.fsi.2014.12.011

Machuca, C. (2021). Efecto inmunoestimulante de β-glucanos aislados de Cystobasidium benthicum sobre células del timo de Totoaba macdonaldi. Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C.

Miest, J. J., Arndt, C., Adamek, M., Steinhagen, D., & Reusch, T. B. (2016). Dietary β-glucan (MacroGard®) enhances survival of first feeding turbot (Scophthalmus maximus) larvae by altering immunity, metabolism and microbiota. Fish & shellfish immunology, 48, 94-104. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.fsi.2015.11.013

Pietretti, D., Vera-Jimenez, N., Hoole, D., & Wiegertjes, G. (2013). Oxidative burst and nitric oxide responses in carp macrophages induced by zymosan, MacroGard® and selective dectin-1 agonists suggest recognition by multiple pattern recognition receptors. Fish & shellfish immunology, 35(3), 847-857. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.fsi.2013.06.022

Reyes-Becerril, M., Alamillo, E., Sánchez-Torres, L., Ascencio-Valle, F., Perez-Urbiola, J. C., & Angulo, C. (2016). Leukocyte susceptibility and immune response against Vibrio parahaemolyticus in Totoaba macdonaldi. Developmental & Comparative Immunology, 65, 258-267. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.dci.2016.07.016

Reyes-Becerril, M., Angulo, M., Sanchez, V., Machuca, C., Méndez-Martínez, Y., & Angulo, C. (2021). β-Glucan bioactivities from Cystobasidium benthicum in Totoaba macdonaldi thymus cells. Fish & Shellfish Immunology, 119, 542-553. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.fsi.2021.10.042

Sanchez, V., Rosales-Mendoza, S., Monreal-Escalante, E., Murillo-Álvarez, J. I., & Angulo, C. (2021). Conjugation of β-glucans on heat-stable enterotoxin (ST) to enhance the immunogenic response in mouse leucocytes. Materials Science and Engineering: C, 118, 111464. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.msec.2020.111464

Vásquez-Piñeros, M. A., Rondón-Barragan, I. S., & Eslava- Mocha, P. R. (2012). Imunoestimulantes em teleósteos: Probióticos, Beta-glucanas e LPS. ORINOQUIA – Universidad de los Llanos – Villavicencio, Meta, 16(1), 46-62. https://doi.org/doi.org/10.22579/20112629.264

Vera-Jimenez, N., Pietretti, D., Wiegertjes, G., & Nielsen, M. (2013). Comparative study of β-glucan induced respiratory burst measured by nitroblue tetrazolium assay and real-time luminol-enhanced chemiluminescence assay in common carp (Cyprinus carpio L.). Fish & shellfish immunology, 34(5), 1216-1222. https://doi.org/doi.org/10.1016/j.fsi.2013.02.004

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