Introducción:

En las células existen las enzimas llamadas ADN polimerasas, las cuales tiene la función de generar nuevas copias de las cadenas de material genético (Tortora et al., 2019). Esta cualidad es aprovechada en los laboratorios para aplicarse en la identificación parental, enfermedades genéticas, patógenos; entre otras, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las bacterias también cuentan con ADN polimerasas, pero específicamente la bacteria Thermus aquaticus produce una ADN polimerasa llamada “Taq polimerasa” descubierta en los años 70’s (Chien et al., 1976). La enzima Taq polimerasa destaca por su estabilidad térmica a temperaturas de 80-95 °C, y por ello es utilizada en técnicas de biología molecular como la PCR (Ishino & Ishino, 2014). Sin embargo, las condiciones de crecimiento de T. aquaticus dificultan la producción de Taq polimerasa y elevan el precio de venta (Chien et al., 1976). Por esta razón se buscan alternativas para la producción de esta enzima.

Las alternativas que se han llevado a cabo para reducir costos son su producción en levadura (Saccharomyces cerevisiae) o bacterias como Vibrio natriegens y Escherichia coli (Hriňová et al., 2024; Zhra et al., 2024). Particularmente, en E. coli se ha realizado la producción en sistemas de expresión pET y métodos de purificación basados en la afinidad a metales, lo que añade costos de procesamiento (Abeldenov & Khassenov, 2014). Una alternativa más barata es el uso directo de extractos de E. coli productora de Taq polimerasa en PCR (Lee et al., 2023). Las cepas de E. coli JM109, DH5α y BL21 son ampliamente utilizadas para la producción de Taq. Mientras que cepas como E. coli TOP10, comúnmente utilizada para clonación de vectores, ha sido poco explorada como producción enzimática (Gómez et al., 2002; Ferralli et al., 2007; Abeldenov et al., 2014; Hriňová et al., 2024).

Para la producción de esta enzima en E. coli se utiliza un vehículo genético llamado pTTQ18 (Figura 1), el cual contiene el gen Taq polimerasa (Gómez et al., 2002). Los componentes de este vehículo genético, nos permiten controlar el momento del inicio de la producción de Taq polimerasa dentro de E. coli mediante el uso de una molécula activadora (inductor). Además, la extracción, almacenamiento y estabilidad de la enzima puede mejorarse mediante la utilización de soluciones específicas compuestas de Tris-HCl, dextrosa, EDTA, DTT, detergentes y/o glicerol (Ferralli et al., 2007). Este enfoque ofrece una alternativa accesible y reproducible, particularmente en laboratorios con recursos limitados, y permite generar cantidades suficientes de enzima para su uso en PCR, demostrando tanto su viabilidad práctica como su potencial aplicación educativa y de transferencia tecnológica.

Figura 1. Vector pTTQ18, utilizado en E. coli TOP10 para expresar Taq polimerasa.

Objetivo: Expresar Taq polimerasa recombinante funcional para su aplicación en PCR.

Materiales y métodos:

Cuatro cultivos independientes de E. coli TOP10 con el plásmido pTTQ18 conteniendo el gen de la Taq polimerasa se sembraron en medio de cultivo LB (10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 10 g/L NaCl, 1.5% agar bacteriológico) con ampicilina (50 mg/L), pH 7.0 ± 0.2. Los cuatro cultivos se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Posteriormente, una colonia de E. coli TOP 10 se tomó por picadura y se colocó en 15 mL de caldo LB (10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 10 g/L NaCl) con ampicilina (50 mg/L), pH 7.0 ± 0.2. De cada cultivo se realizó una resiembra y los 4 cultivos resembrados en caldo se incubaron a 37 °C por 72 horas.

Del cultivo E. coli TOP 10 se tomaron 200 μL, la absorbancia de cada muestra se midió a 600 nm y el UFC se determinó mediante una curva de calibración abs vs UFC. Finalmente, en 3 cultivos se agregó 30 μL de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (0.1 M) y 1 cultivo se apartó como control negativo (sin IPTG). Los 4 cultivos se incubaron a 37 °C por 24 horas.

Después de la incubación, los cultivos se repartieron en microtubos con 1 mL y fueron centrifugados a 8871 x g por 5 min. El sobrenadante de los tubos se decantó y el pellet se resuspendió en 70 μL buffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.9,50 mM dextrosa, 1 mM EDTA); el pellet resuspendido se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos.

En cada tubo se añadió 70 μL de buffer B (10 mM Tris-HCl pH 7.9, 50 mM KCl, 0.5% Tween 20, 0.5% Triton X-100), los tubos se incubaron en baño María a 75 °C por 30 min y cada 5 minutos se mezcló por inversión. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 9660 x g por 5 minutos y 120 μL se separon en nuevos microtubos. Finalmente, al sobrenadante recuperado se le añadió 120 μL de buffer de almacenamiento (50mM Tris-HCl pH 7.9, 100mM NaCl, 0.5 mM DTT, 1% Triton X-100, 50% Glicerol) y las muestras fueron almacenadas a 4 °C.

La enzima extraída dentro de las muestras se identificó mediante electroforesis SDS-PAGE con 20 μL de extracto, comparando las bandas observadas con un marcador de peso molecular (Precision Plus Protein BIO-RAD). Asimismo, con la Taq polimerasa extraída se realizó una PCR de punto final para evaluar la funcionalidad con 1 μL y 2 μL del extracto proteico (Figura 2). Finalmente, la concentración del extracto proteico a 94 kDa se determinó mediante densitometría con el software ImageJ (https://imagej.net/ij/).

Figura 2. Metodología para la producción de Taq polimerasa recombinante. Paso 1: Cultivar E. coli TOP 10 en medio LB ampicilina. Paso 2: Inducir expresión con IPTG. Paso 3: Incubar a 37°C por 72 horas. Paso 4: Centrifugar y recuperar el pellet. Paso 5: Agregar misma cantidad de buffer A y B. Paso 6: Baño maria por 30 min a 70°C. Paso 7: Agregar misma cantidad de buffer al sobrenadante recuperado. Paso 8: Realizar una electroforesis SDS PAGE. Paso 9: Evaluar enzima en PCR.

Resultados y discusión:

La Taq polimerasa recombinante se identificó a 94 kDa en la electroforesis SDS-PAGE realizada (Figura 3) que corresponde al tamaño esperado de esta enzima (Ferralli et al., 2007).  Sin embargo, se puede observar presencia de otras proteínas y es común debido a la presencia de cuerpos de inclusión por proteínas mal plegadas (Bhatwa et al., 2021). Por otro lado, dentro del primer carril se percibe una tenue banda a 94 kDa, que podría corresponder a proteínas endógenas de peso molecular similar a la Taq polimerasa producida (Torres, 2025). Asimismo, comparando con resultados ya publicados, esta tenue banda puede representar una expresión basal del gen de Taq polimerasa cuando no fue realizada una inducción (Fang et al., 2016; Hriňová et al., 2024). Con los extractos se realizó una PCR (Figura 3), y se identificó mayor amplificación con 1 μL en comparación a 2 μL del extracto proteico. Una cantidad alta de enzima como la añadida en 2 μL, en relación con la cantidad de ADN molde y primers, induce efectos negativos como formación de productos no deseados o dímeros de primers (Ingr et al., 2015). Es decir, se pueden desbalancear las concentraciones dentro de la mezcla de componentes de la PCR y así afectar la amplificación del ADN, como lo demostraron Markoulatos et al. (2002). Finalmente, las enzimas presentaron concentraciones de 135-196 ng/μL (Tabla 1) y, en comparación con el control negativo que mostró una expresión basal de la proteína, se observó un ligero incremento en las muestras inducidas con IPTG, tal como lo reportaron Ferralli et al. (2007). Los extractos crudos presentaron concentraciones de 135–196 ng/µL, lo que equivale a aproximadamente 13–39 U/µL, considerando que 1 U corresponde a 5–10 ng de enzima pura. De este modo, la cantidad de proteína obtenida es suficiente para sustituir la dosis estándar de 1 U utilizada en una reacción de PCR de 25 µL, demostrando que la enzima expresada en E. coli TOP10 posee un rendimiento comparable al de las preparaciones comerciales (Promega, 2025). En un análisis comparativo, el costo por reacción de Taq recombinante se estima en 0.37–0.92 MXN, frente a 3.67–9.18 MXN de la Taq comercial, lo que representa hasta 10 veces de ahorro y refuerza su viabilidad económica (ThermoFisher, 2025). Por lo tanto, no solo cepas como E. coli JM109, DH5α y BL21 poseen la capacidad de producir la enzima Taq, sino que también E. coli TOP10 con el vector pTTQ18 puede hacerlo, ofreciendo mayor versatilidad y ampliando las oportunidades de producción con distintas cepas disponibles (Gómez et al., 2002; Ferralli et al., 2007; Abeldenov et al., 2014; Hriňová et al., 2024).

Figura3. (a) Electroforesis SDS PAGE para identificar Taq polimerasa con un tamaño de 94 kDa. Carriles: Marcador (Precision Plus Protein) 1 control negativo (Cultivo no inducido), 2-3 taq recombinante 1, 4-5 taq recombinante 2 y 6-7 taq recombinante 3. (b) Electroforesis de productos de PCR. Carriles: Marcador (1Kb plus) 1 control positivo (taq comercial), 2-4 taq recombinante 1 μL, 5-7 taq recombinante con 2 μL y 9-11 controles negativos.

Conclusiones:

La Taq polimerasa recombinante fue producida en cepas de E. coli TOP 10 que contenían el vector de expresión pTTQ18. Los resultados indican que E. coli TOP 10 produjo la enzima Taq polimerasa con un peso esperado de 94 kDa, con una concentración del extracto proteico entre 135-196 ng/μL y fue funcional en la PCR cuando se utilizó 1 μL de extracto conteniendo la enzima, lo que demuestra su potencial uso en el laboratorio, su aplicabilidad en contextos educativos y de investigación de bajo costo.