Introducción

Vibrio parahaemolyticus es una bacteria Gram negativa que causa la enfermedad llamada vibriosis en organismos acuáticos y se asocia a gastroenteritis aguda en humanos por consumo de mariscos (Letchumanan, Chan & Lee, 2014). Las investigaciones recientes han reportado aislamientos de V. parahaemolyticus resistentes a antibióticos (Zhang et al, 2024), lo que demuestra la necesidad de buscar nuevas estrategias de prevención, control y tratamiento. Las vacunas recombinantes producidas en microalgas y administradas oralmente pueden proteger contra diversas enfermedades (Specht & Mayfield, 2014; Ramos-Vega et al., 2018). Recientemente se reportó que la inmunización de peces con la toxina similar a PirA (ToxA) purificada estimuló el sistema inmune innato e indujo la producción de anticuerpos IgA e IgG, proporcionando protección contra V. parahaemolyticus (Reyes-Becerril et al, 2017; Reyes-Becerril et al, 2016). La exploración de la respuesta inmune de Tox A producida en microalgas, evaluada en modelos mamíferos contribuiría a robustecer la posibilidad de su uso como vacuna en humanos.

Objetivos

Determinar la inmunogenicidad de la ToxA producida en la microalga Schizochytrium sp. en modelo de ratón.

Materiales y métodos

Producción de la Toxina A en la microalga Schizochytrium sp. La transformación transitoria de Schizochytrium sp. mediante Agrobacterium tumefaciens se llevó a cabo conforme el protocolo descrito por Bañuelos-Hernández et al (2017). El cultivo se recuperó a las 48 h post-inducción por centrifugación (13,723 x g por 15 min). La biomasa total recuperada se liofilizó a -80° C por 8 h. Posteriormente, la proteína total (PT) se extrajo a partir de la biomasa liofilizada (Franklin et al, 2002) y se cuantificó por el método de Bradford (Waterborg y Matthews, 1994). El antígeno recombinante se visualizó por la técnica Western blot, previa electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12% (120 V por 3 h en frío) utilizando 20 µg de Tox A (35 µl de muestra y 5 µl de buffer de carga 5x) y sueros policlonales obtenidos previamente de ratones inmunizados con la ToxA purificada siguiendo el método descrito por Monreal-Escalante et al. (2019). Los niveles de ToxA en la microalga Schizochytrium sp. se cuantificaron usando los anticuerpos policlonales de suero anti-ToxA por ELISA indirecto (Monreal-Escalante et al., 2019).

Evaluación inmunogénica de la Toxina A producida en la microalga Schizochytrium sp. Cuatro grupos de ratones BALB/c (n=5 por grupo) fueron inmunizados por la vía oral (10 µg/ratón de Tox A) y subcutánea (5 µg/ratón) los días 1, 8, 15 y 22 con la microalga productora de la ToxA (grupo ToxA) o usando la microalga silvestre (WT) como control negativo. Los días 28 y 58 se tomaron muestras de sangre y heces para cuantificar los niveles de anticuerpos IgA e IgG mediante ELISA indirecto (Monreal-Escalante et al., 2019) (Figura 1).

Figura 1. Esquema de inmunización para la evaluación de la inmunogenicidad de ToxA producida por Schizochytrium sp. en ratones de la línea BALB/c de 6 a 8 semanas de edad.

Resultados y Discusión

La evaluación en ratones BALB/c demostró que la ToxA producida en la microalga Schizochytrium sp. es inmunogénica por la vía oral, ya que indujo la producción significativa de anticuerpos específicos IgA anti-ToxA a nivel de mucosa intestinal en el día 28 (Figura 2a). Este efecto también se observó a largo plazo (día 58), indicando la posible inducción de memoria inmunológica (Figura 2a). Como se esperaba, la administración de la ToxA producida en la microalga Schizochytrium sp. por vía subcutánea en ratones no estimuló la producción de IgA en la mucosa intestinal (Figura 2b).

Figura 2. Producción de inmunoglobulina A anti-ToxA en heces de ratón BALB/c por la vía a) oral días 28 y 58 (largo plazo) y b) subcutánea días 28 y 58 (largo plazo). Schizo: WT = Schizochytrium sp.-Silvestre; Schizo: ToxA = Schizochytrium sp.-Transgénica. Observandose diferencia significativa entre los grupos p<0.05.

La producción de anticuerpos IgG anti-ToxA en suero fueron mayores en los ratones inmunizados vía oral y subcutánea con la microalga productora de la ToxA respecto al grupo de animales control que se les administró la microalga silvestre (WT) al día 28 (Figura 3a,b). El nivel de anticuerpos IgG anti-ToxA en suero a largo plazo (día 58) disminuyó en todos los grupos; sin embargo, fue superior en los ratones inmunizados vía oral y subcutánea con la microalga productora de la ToxA. En el estudio realizado por Reyes-Becerril et al. (2016, 2017), la ToxA administrada en el huachinango del Pacífico (Lutjanus peru) y la Dorada (Sparus aurata) estimuló el sistema inmune de los peces. En otro estudio, Monreal-Escalante et al. (2019) reportaron que ratones BALB/c que recibieron por la vía oral la ToxA producida en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) produjeron anticuerpos específicos contra la toxina, pero no se logro demostrar la presencia de anticuerpos a largo plazo. Aunque estos resultados fueron prometedores, consideramos necesario evaluar la respuesta inmune de ToxA en una plataforma comestible con el proposito de explorar su papel como prototipo de vacuna oral.

Figura 3. Producción de inmunoglobulina G anti-ToxA en suero de ratón BALB/c por la vía a) oral día 28 y 58 (largo plazo) y b) subcutánea día 28 y 58 (largo plazo). Schizo: WT = Schizochytrium sp.-Silvestre; Schizo: ToxA = Schizochytrium sp.-Transgénica.

Conclusiones

La microalga Schizochytrium sp. es capaz de producir la ToxA y su administración por vía oral y subcutánea en ratones BALB/c indujo una respuesta humoral mediante la producción de anticuerpos IgG e IgA detectada en heces y suero sanguíneo. En general, la producción de IgG en suero fue mayor en el grupo inmunizado por la vía subcutánea, mientras que la producción de IgA fue mayor en la mucosa intestinal en el grupo inmunizado por la vía oral.