Introducción

Los peces y mariscos son consumidos en el mundo. (Parlapani, 2021). Sin embargo, estos alimentos pueden contaminarse con patógenos, entre los que destaca Vibrio parahaemolyticus (Letchumanan et al., 2019). Esta bacteria produce toxinas hemolisina directa termostable (TDH), hemolisina relacionada con TDH (TRH) y la proteína TLH que provocan vómito, diarrea aguda y hasta la muerte (Hong et al., 2018). Estudios recientes demuestran que existen alternativas contra V. parahaemolyticus, entre ellas la vacunación (Mdarhri et al., 2022; Ji et al., 2020). Las vacunas recombinantes son una alternativa actual para el tratamiento de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Estas vacunas se producen mediante ingeniería genética, que consiste en una construcción elaborada con ADN circular (plásmido) y un gen que expresa una proteína con la capacidad de estimular el sistema inmune (Daniali et al., 2024). En su producción comúnmente se utiliza el plásmido pBi121, que emplea la maquinaria genética de células vegetales para la producción de la vacuna recombinante (Monreal-Escalante et al., 2019).

Objetivos

Generar la construcción genética (pBi121::genVp) que codifique para un antígeno compuesto de los factores de virulencia de V. parahaemolyticus para su posible expresión en plantas.

Materiales y métodos

Dos cultivos independientes de Escherichia coli TOP 10, que contenían las construcciones pUC57::gen_VP y el plásmido pBi121, respectivamente, se propagaron en medio LB con kanamicina 50 mg/L durante 2 días a 37 ^oC. Posteriormente, la extracción de ADN plasmídico se realizó por el método de lisis alcalina (Sambrook et al, 1989). A continuación, la digestión enzimática del plásmido pUC57 se realizó a 37 ^oC durante 20 minutos con SmaI-SacI para abrir el plásmido y liberar el “gen_VP” (Monreal-Escalante et al., 2019). Los productos de la digestión fueron separados en una electroforesis en gel de agarosa al 1% a 75 V por 40 minutos, donde las bandas cortadas se purificaron conforme al kit QIAEX II Gel Extraction (QIAGEN^®) y los productos se resguardaron a -20 ^oC. La reacción de ligación con la enzima T₄ ADN ligasa se llevó a cabo durante 24 horas a 4 ^oC, uniendo el gen_VP con el plásmido pBi121 para generar la construcción pBi121::gen_VP (Villegas, 2023).

Para replicar la construcción genética pBi121::gen_VP, células de E.coli TOP10 (Invitrogen® C404003^TM) se transformaron mediante el método de choque térmico, sembrando las células en medio LB con kanamicina a 50 mg/L e incubándolas a 37 ^oC durante 2 días. Posteriormente, se extrajo la construcción genética por un método alcalino, seguido de una PCR de punto final para confirmar la presencia del gen_VP (Sambrook et al, 1989). A continuación, la transformación de Agrobacterium tumefaciens GV-3101 con la construcción pBi121::gen_VP se realizó por electroporación a 1.8 V, sembrando las células en medio YM con kanamicina a 50 mg/L e incubándolas a 28 ^oC durante 4 días. Finalmente, se realizó otra extracción alcalina de la construcción genética y posteriormente una PCR de punto final para confirmar las clonas positivas (Monreal-Escalante et al., 2019) (Figura 1).

Figura 1. Los 8 pasos generar una construcción genética. Paso 1: replicación de pUC57::gen_Vp. Paso 2: extracción por lisis alcalina. Paso 3: liberar el gen_Vp y abrir el plásmido pBi121 con enzimas. Paso 4: ligar el gen_Vp con el plásmido pBi121. Paso 5: transferir pBi121::gen_Vp a E.coli por choque térmico. Paso 6: confirmar la transferencia por PCR punto final. Paso 7: transferir pBi121::gen_Vp a A. tumefaciens mediante electroporación. Paso 8: infectar plantas A. tumefaciens con pBi121::gen_Vp.

Resultados y Discusión

Con la liberación del gen_VP del plásmido comercial pUC57 (Figura. 2) y su inserción en el plásmido pBi121 se generó la construcción pBi121::gen_VP. La construcción genética se clonó en E.coli para replicarla y así obtener suficientes copias; para posteriormente clonarla en A. tumefaciens; y finalmente confirmar las clonas positivas mediante PCR de punto final, obteniendo como resultado en ambos casos un amplicón de 1,100 pb (Figura. 3). La construcción genética pBi121::gen_VP se elaboró con el propósito posterior de utilizarla para la transformación de plantas, ya que las células vegetales son utilizadas como plataforma para la expresión de proteínas recombinantes en la producción de vacunas orales (Monreal-Escalante et al., 2019).

Figura 2. Perfil de restricción del pUC57::gen_VP y de pBi121. Carril 1: marcador 1 kb plus. Carriles 3-6: liberación del gen_Vp de 2,300 pb. Carriles 7-10: apertura del plásmido pBi121con un tamaño de 12,000 pb.

Conclusión

La construcción genética pBi121::gen_VP se generó con base en un gen de un antígeno compuesto de los factores de virulencia de V. parahaemolyticus, que fue posible clonar en E. coli y en A. tumefaciens para su uso en la transformación genética de plantas para la expresión de la vacuna recombinante.

Figura 3. Producto de PCR de clonas de E. coli TOP10. Carril M: marcador de peso molecular 1 kb plus. Carril C+: control positivo. Carril C-: control negativo. Carriles 2, 3, 6 y 7: amplicon 1,100 pb del gen_VP.