Introducción

La mayor mortalidad de los bovinos lecheros ocurre en el periodo neonatal, que es durante los primeros 30 días después del nacimiento y es principalmente asociada a infecciones (Mee, 2023). La mala higiene de los pesebres, la suciedad en los pezones de las madres y mal calostrado, predisponen a los becerros a infectarse desde las primeras horas de vida.  Escherichia coli causa colibacilosis en los establos lecheros, y es resistentes a los antibióticos usados de manera común como tratamiento. En este sentido, el sistema inmune del cuerpo puede ser estimulado por sustancias producidas por levaduras (Schlabitz et al., 2022), principalmente por carbohidratos de tipo beta-glucano, para controlar infecciones por E. coli (Liu et al., 2021; Machuca et al., 2022). Por lo anterior, en este trabajo se investigó el efecto de la administración oral de beta-glucano, obtenido de una levadura marina (Debaryomyces hansenii CBS 8339), sobre la respuesta inmune en becerras Holstein recién nacidas.

Materiales y métodos

Se cultivó Debaryomyces hansenii CBS 8339 en medio YPD (5 g extracto de levadura, 10 g de peptona y 10 g de dextrosa por litro, Sigma, St. Louis MO, USA) a 30 °C en agitación a 150 revoluciones por minuto (r.p.m.) por 24 horas. La biomasa del cultivo se obtuvo por centrifugación (2500 r.p.m. por 15 minutos) y se liofilizó (LABCONCO, MO, USA) durante 24 horas. Posteriormente, la biomasa se incubó con una solución de hidróxido de sodio (3 %) y se calentó a 100 °C por 3 horas. La suspensión se centrifugó (6297 g x 15 min) y se añadió ácido acético (0.5 N) para resuspender el precipitado (75 °C por 6 horas). En seguida, se agregaron 40 mL de etanol y el material se calentó a punto de ebullición por 15 minutos. Por último, se centrifugó para obtener el beta-glucano que fue liofilizado para su uso.

El beta-glucano se administró por vía oral en una solución amortiguadora (PBS) (a 40 mg mL^-1) a cinco terneras (becerras) Holstein de uno a cinco días de nacidas (Grupo beta-glucano de D. hansenii CBS 8339); en un esquema de dos dosis separadas por tres días (Fig. 1), cada dosis fue de 5 miligramos por kilogramo de peso vivo. Cinco becerras sólo recibieron 5 mililitros de la solución amortiguadora en dos dosis (grupo Control). Al día 7 se tomó una muestra de sangre para aislar monocitos (células del sistema inmune). Un millón de monocitos (1 × 10⁶ cel mL^-1) se cultivaron en placas por 12 horas a 37 °C con CO₂ (5 %), luego fueron infectados con la bacteria patógena Escherichia coli 25 (1 × 10⁸ UFC mL^-1) y se volvieron a incubar por 4 y 24 horas a 37 °C. A las 4 y 24 horas se tomaron muestras para analizar la expresión de genes y parámetros asociados al sistema inmune. Los parámetros inmunes estudiados con técnicas convencionales fueron la actividad fagocítica (Teng et al. 2015), la producción de óxido nítrico (Neumann et al., 1995), y la actividad de la mieloperoxidasa (Quade y Roth, 1997). Los genes analizados por el método de Livak y Schmittgen (2001) fueron el receptor TLR2 (tlr2), el factor de transcripción NF-kB (nfκb), y la citocina TNF-a (tnf-α).

Figura 1. Esquema de administración de los beta-glucanos de Debaryomyces hansenii CBS 8339  en terneras Holstein recién nacidas.

Resultados y discusión

El sistema inmune de rumiantes madura hasta el primer año de vida (Colditz et al., 1996), por lo que la estimulación en el primer mes de vida puede ayudar a combatir enfermedades infecciosas, como la colibacilosis. Después de la infección con el patógeno (E. coli 25), la actividad fagocítica, la producción de óxido nitrico y la actividad mieloperoxidasa aumentaron de forma estadísticamente significativa (p < 0.05) en los monocitos de las terneras que recibieron vía oral el beta-glucano de D. hansenii CBS 8339, en comparación con los parámetros evaluados en los monocitos de las becerras del grupo Control que sólo recibieron la solución amortiguadora (PBS) (Fig. 2).

Figura 2. Respuesta de parámetros inmunológicos (fagocitosis, producción de óxido nítrico y actividad mieloperoxidasa) en monocitos de terneras que recibieron vía oral el beta-glucano de D. hansenii CBS 8339 y en monocitos del grupo Control. Los monocitos fueron infectados con E. coli 25.

La actividad fagocítica consiste en la habilidad de los monocitos para comerse a los patógenos y destruirlos (digerirlos) en su interior (Hussen y Schuberth, 2017). Para destruirlos, los monocitos producen óxido nítrico, que es una molécula tóxica para los patógenos (MacMicking et al., 1997). Además, la enzima mieloperoxidasa dentro de los monocitos genera ácido hipocloroso con actividad microbicida (mata a los microbios) (Aratani, 2018). Es decir, los resultados indican que los monocitos de las becerras suplementadas con el beta-glucano de D. hansenii CBS 8339 tuvieron una mayor capacidad de defensa inmune para eliminar al patógeno E. coli 25.

La expresión de genes es un proceso en el cual la información contenida en un gen se transmite a moléculas de ácido ribonucleico (ARN) mediante el proceso de transcripción que indica cuanto y cuándo se sintetizarán proteínas en el proceso de traducción. La expresión de los genes tlr2, nfκb, y tnf-α se incrementó significativamente (p < 0.05) después de la infección con el patógeno (E. coli 25) en los monocitos de las becerras del grupo beta-glucano de D. hansenii CBS 8339 en comparación al nivel de expresión de esos genes en los monocitos de las becerras del grupo Control (Fig. 3).

Figura 3. Comparación de los niveles de expresión de genes asociados al sistema inmune (TLR2, NFκB y TNF-α). Incrementados (p < 0.05) en monocitos de terneras que recibieron vía oral el beta-glucano de D. hansenii CBS 8339 contra los del grupo control. Los monocitos fueron infectados con E. coli 25.

El TLR2 (tlr2) es un receptor de glucanos y se encuentra en la superficie de los monocitos (Takeda y Akira, 2004). Al reconocer el beta-glucano de D. hansenii CBS 8339, el TLR2 manda la señal para que se active el nfκb que se encuentra en el citoplasma de los monocitos. Posteriormente, el nfκb se introduce al núcleo y se une al ADN para activar la transcripción del tnf-α (Takeda y Akira, 2004). Finalmente, el tnf-α se encarga de estimular a los monocitos para aumentar la potencia de sus funciones, como son la producción de óxido nítrico y la actividad mieloperoxidasa, entre otras (Idriss y Naismith, 2000; Kushibiki, 2011). De esta manera se puede explicar el mecanismo de inmuno-estimulación de los monocitos de becerras administradas oralmente con beta-glucano de D. hansenii CBS 8339.

Conclusiones

Los resultados indican que la administración del beta-glucano de Debaryomyces hansenii CBS 8339 estimuló las defensas de becerras recién nacidas, con efectos positivos tanto de parámetros inmunológicos (fagocitosis, producción de óxido nítrico y actividad mieloperoxidasa), como en la expresión de genes (tlr2, nfκb, y tnf-α) que, en todos los casos, están asociados directamente con el sistema inmune y su respuesta ante patógenos.