Introducción

La industria del tomate es una de las más globalizadas y de mayor superficie en comparación con otras hortalizas. Su producción es significativamente afectada por fitopatógenos. Entre éstos, destaca Clavibacter michiganensis subespecie michiganensis (Cmm), el agente causal del cáncer bacteriano de tomate, enfermedad cuarentenaria que causa pérdidas inclusive totales de los cultivos (Nandi et al. 2018). Ante esto, se han propuesto alternativas innovadoras de estudio y aplicación de bacterias como agentes de control biológico en plantas. Al respecto, se han identificado diversos mecanismos de acción de algunas bacterias que protegen a los cultivos de tomate del daño por Cmm, destacando la producción de 1) moléculas antimicrobianas, 2) enzimas líticas y sideróforos, y 3) la estimulación de la resistencia sistémica del hospedero (Takishita et al. 2018). En este contexto, los recursos microbianos presentes en los ecosistemas marinos y costeros; poco explorados, pueden tener aplicaciones potenciales en agricultura, por lo que las bacterias aisladas de estos sitios resultan prometedoras para su estudio (Ghodino 2010).

Objetivos

Seleccionar bacterias que actúen como agentes de control biológico contra Cmm, agente causal del cáncer bacteriano de tomate, mediante un estudio de bioprospección de microorganismos aislados de ambientes marinos y costeros.

Materiales y métodos

Se aislaron bacterias de ambientes marinos y costeros de Baja California Sur. Los sitios de muestreo fueron: 1). Rizósfera de salicornia y suelo en ¨Dunas Don Miguelito¨ (Guerrero Negro, B.C.S., 27°57´00”N 114°07´36”O) (n =16), 2). Sedimento marino (n =6) y, 3). Ventila hidrotermal somera en Santispac (n =2) (Golfo de California, Mulegé, B.C.S., 26°53´22”N 111°57´08”O). Las bacterias fueron aisladas de tres muestreos en los mismos sitios, en julio de 2015, noviembre de 2016 y diciembre de 2018, y fueron purificadas y preservadas a -80°C. De los aislados obtenidos, se seleccionaron un total de 24 bacterias que mostraron actividad antimicrobiana en estudios previos contra bacterias Gram negativas (Staphylococcus aureus) y Gram positivas (E. coli, Salmonella typhi y Aeromonas hydrophila), y se caracterizó su potencial como agentes de control hacia Cmm. Se realizaron pruebas in vitro de antagonismo y de actividad antimicrobiana de sobrenadantes bacterianos por difusión en agar (secreción de compuestos bioactivos) y mediante la técnica de microdilución con rezasurina (viabilidad celular).

Con base en los resultados observados en las pruebas anteriores, se seleccionaron las 5 bacterias con mayor potencial y se realizó un experimento para determinar la capacidad de protección contra Cmm. El experimento se realizó con plántulas de tomate (variedad rio grande) con 10 días de desarrollo en condiciones in vitro a 28°C con fotoperíodo 16/8 horas de luz/oscuridad. Debido a la patogenicidad y el riesgo de dispersión ambiental de Cmm, este experimento se realizó en cajas magenta con solución nutritiva Hoagland y con filtro para el intercambio de gases.

Cada grupo tratamiento consistió en (plántulas + bacteria + Cmm): (1) 10 plántulas de tomate, inoculadas con (2) la bacteria seleccionada (1×10⁷UFC/mL), y retadas con (3) Cmm (1×10⁷UFC/mL). Las bacterias seleccionadas se inocularon al medio y raíz, mientras que Cmm se inoculó mediante la técnica de punción en el tallo. Posteriormente, a los 22 días posteriores a la inoculación con Cmm y con la aparición de síntomas asociados al cáncer bacteriano de tomate (disrupción del tallo, marchitez, clorosis y ondulamiento foliar) (Blancard 2012), se analizó el grado e incidencia en el grupo tratamiento (plántulas + bacteria + Cmm) y en el grupo testigo (plántulas + Cmm). Finalmente, las 5 bacterias que mostraron mayor potencial en los estudios de actividad antimicrobiana y en el ensayo con plántulas de tomate se identificaron mediante técnicas moleculares (secuenciación y comparación del gen 16s ARNr) (Jungy et al. 2014).

Resultados y Discusión.

Los ambientes marinos y costeros son lugares donde la competencia para la supervivencia es un factor importante para la adaptación de bacterias, especialmente en ambientes áridos y con altas concentraciones de sal (Ghodino 2010). En este estudio de bioprospección (Fig. 1), a partir de muestras recolectadas de este tipo de ambientes, se logró identificar satisfactoriamente cinco bacterias con potencial antagónico contra Cmm.

Figura 1. Diagrama general de la metodología realizada para el aislamiento e identificación de bacterias con capacidad antagónica contra el fitopatógeno Cmm (Guerra et al. 2020).

Del total de aislados evaluados, las cepas denominadas como Bacillus sp, 367, Bacillus sp. 475B, Bacillus sp. 1118A y Bacillus sp. 1118B tuvieron actividad antagónica, ya que formaron halos de inhibición del crecimiento de Cmm de entre 17 y 25 mm (Fig. 2). Esta inhibición se puede deber a una interacción directa bacteria-bacteria de competencia por espacio y nutrientes. Por otra parte, solo los sobrenadantes de los aislados Bacillus sp. 367 y Bacillus sp. 475B tuvieron un efecto de inhibitorio de hasta el 98% del crecimiento de Cmm en la prueba de microdilución con rezasurina (in vitro). En este caso, se ha reportado que algunas cepas de Bacillus subtillis pueden inhibir el desarrollo de Cmm mediante la secreción de lipopéptidos antimicrobianos que interactúan e inestabilizan la membrana bacteriana (Jung et al. 2014).

Figura 2. Actividad antimicrobiana del sobrenadante frente a Cmm, mediante técnicas de difusión. A). Método de difusión en disco, B). Método de difusión en pozo de agar. Control +: estreptomicina (0.5 mg/mL) (Guerra et al. 2020).

En las plántulas de tomate se observó que el aislado Ochrobactrum sp. 360 disminuyó todos los síntomas en más del 80% (Fig. 3). Sin embargo, este aislado no presentó actividad antagónica frente a Cmm. Es posible que el efecto pudo ser la estimulación de la resistencia sistémica de la planta, ya que se ha reconocido como un mecanismo por los cuales algunas bacterias brindan protección a su hospedero. No obstante, los resultados alentadores en laboratorio es necesario hacer pruebas en campo que permitan determinar la eficacia y validación contra el cáncer bacteriano del tomate.

Figura 3. Cultivo in vitro de plántulas de tomate en sistema hidropónico, con 22 días en contacto con el fitopatógeno Cmm e inóculo bacteriano (control biológico). Síntomas evaluados: A). Clorosis, B). Marchitez de hojas, C). Ondulamiento foliar, D). Disrupción de tallo, E). Testigo infectado con Cmm y F). Tratamiento con Ochrobactrum sp. e infectado con Cmm. Todos los cultivos en Solución de Hoagland 25% (Guerra et al. 2020).

Conclusiones

En este estudio de bioprospección se logró identificar 5 bacterias con potencial como agentes de control biológico de Cmm. Entre estos aislados, destacaron Bacillus sp. 367 (Dunas), Bacillus sp. 475B (Ventila hidrotermal somera) y Ochrobactrum sp. 360 (Dunas). Bacillus sp. 367 y Bacillus sp. 475B tienen capacidad antimicrobiana contra Cmm mediante la secreción de moléculas. Los aislados Bacillus sp. 1118A y 1118B mostraron antagonismo mediante contacto directo con Cmm, probablemente por competencia de espacio y nutrientes. En cuanto al efecto protector en plántulas de tomate infectadas con Cmm, Ochrobactrum sp. (360) disminuyó significativamente la frecuencia y severidad de los síntomas del cáncer bacteriano in vitro, probablemente mediante la estimulación de la resistencia sistémica de la planta. Con el fin de elucidar los mecanismos de las actividades biológicas observadas, las perspectivas son: 1). Realizar un estudio en invernadero y evaluar la interacción en el sistema planta – microorganismo y 2). Caracterizar las moléculas de los sobrenadantes con actividad antimicrobiana.