Introducción

El bambú es un recurso natural que ha sido aprovechado intensamente por el hombre durante milenios en las regiones más populosas de la Tierra. Desde tiempos inmemorables el hombre del trópico ha utilizado una gama de diferentes especies locales de bambúes, como materia prima para la construcción de casas, balsas, puentes, armas, herramientas y alimentación (Dransfield y Widjaja, 1995). Los bambúes pertenecen a la familia de las gramíneas (Cortés, 2000). En el mundo se reconocen 90 géneros y unas 1, 040 especies de bambúes, que se distribuyen desde los 46ºde latitud norte hasta los 47º de latitud sur, y desde el nivel del mar hasta los 4 000 metros de altura en los Andes ecuatoriales (Cortés, 2000). Judziewicz y cols. (1999) reportan para América 21 géneros y 345 especies, que se localizan desde el sur de Estados Unidos, México, Centro y Sudamérica, en las Islas del Caribe, y hasta el sur de Chile. En México se tienen registrados 8 géneros y 39 especies nativas de bambúes; sin embargo, de acuerdo con Cortés, (2000), el número de especies descritas para México aumentaría si se pudiera contar con más colecciones, principalmente de Chiapas, Oaxaca y Veracruz donde se encuentra el mayor número de las especies descritas. Cortés (2000) reportó que también hay bambúes que han sido introducidos de Asia como por ejemplo el bambú amarillo (Bambusa vulgaris var. vittata), bambú plumoso o plumilla (Phyllostachys aurea), madake o plumoso (Phyllostachys bambusoides), o el bambú colombiano (Guadua angustifolia).

Objetivos

El objetivo fue generar una metodología eficiente para el establecimiento in vitro de segmentos nodales de bambú (Guadua angustifolia Kunth), bajo condiciones asépticas para su micropropagación.

Materiales y Métodos. El material vegetal fue obtenido de una plantación comercial ubicada en el Ejido Allende bajo del municipio de Macuspana, Tabasco, México (N17°41´27.4128´´; W92°25´26.8752´´) (Figura 1).

Figura 1. A) Cepa de bambú joven  en etapa de crecimiento. Edad de la cepa 6 años, edad del tallo 1 año, altura 12mts, diámetro 10cm). B) Cepa de bambú en condiciones óptimas para su comercialización. Edad de la cepa 9 años, edad del tallo 3 años, altura 12mts, diámetro 10cm). C) Chusquín de bambú aproximadamente 1m de altura.

Etapa 1.- Segmentos nodales (1cm) fueron lavados con agua jabonosa (25 min) y enjuagues con agua destilada estéril (ADE). Posteriormente, en una cámara de flujo laminar, el procedimiento aséptico se llevó a cabo mediante la inmersión en hipoclorito de sodio (NaClO) al 6% (20 min + 3 enjuagues con ADE); inmersión en etanol 90% (20min + 3 enjuagues con ADE). Seguidamente, 100 explantes fueron sembrados individualmente en frascos de cristal (Gerber^MR), conteniendo 20 mL del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962), pH 5.5, sacarosa 30 gr/L, gelificado con agar (7 gr/L) e incubados a 25°C y luz constante (1800 luxes luz blanca). Durante la primera semana de incubación, se observó crecimiento de diversos morfotipos de hongos, los cuales fueron subcultivados en medio PDA (Marca BIOXON, No. Catálogo BD211900) e incubados a 28°C, bajo condiciones de obscuridad durante 15 días. Se realizaron preparaciones semipermanentes para su identificación, mediante análisis microscópico, basada en la morfología de las estructuras vegetativas y esporas (Dade y Gunnell, 1969). Seguidamente se realizó una revisión bibliográfica para determinar los fungicidas que han sido empleados para la eliminación de dichos microorganismos.

Etapa 2.- Un nuevo lote de segmentos nodales fue lavado en agua jabonosa (como se describió en la etapa 1). El experimento consistió en inmersión por 24 h de los segmentos nodales, en los siguientes tratamientos (Productos comerciales): T0= Control (ADE), T1= Captan (Nombre químico  N – (triclorometiltio) ciclohex-4-eno –1,2 –dicarboximida) 4 g/L, T2= Mancozeb (Nombre químico Etilen bis (ditiocarbamato) de manganeso con sal de zinc) 4 g/L, T3= Captan + Mancozeb 4 g/L, T4= Captan + Mancozeb 2 g/L (previo al cultivo in vitro).  Seguidamente en cámara de flujo laminar se aplicó el procedimiento aséptico descrito en la etapa 1. El medio de cultivo MS, fue suplementado con Benomyl (Nombre químico metil 1-(butilcarbamoil)bencimidazol-2-il carbamato) (2 g/L) + Gentamicina (2ml/L) posterior a la esterilización en autoclave. Diez explantes por tratamiento, fueron sembrados e incubados a 25 °C y luz continua (1800 luxes luz blanca). Se realizó análisis de varianza de un diseño completamente al azar y prueba de medias DMS (P≤0.05), empleando el programa estadístico MENU de la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León (FAUNL). Los datos en porcentaje (Frecuencia de los microorganismos identificados), fueron transformados mediante la ecuación arcsin [√ (%/100)].

Resultados y Discusión. Etapa 1.- Hongos filamentosos fueron observados a partir de los 5 días después de la siembra (dds) en el 65% de los cultivos de segmentos nodales, incrementándose al 100% a los 10 dds.  De acuerdo con las guías de Dade y Gunnell, (1969), se identificaron cuatro especies, con base en la morfología de la estructuras vegetativas y esporas. Los hongos encontrados (Fig. 2) con mayor frecuencia fueron Alternaria sp. 35%, Cladospirium herbarum 31%, Aspergillus sp. 25%, mientras que Fusarium solani 9%b (letras iguales significa que no hay diferencias estadísticas, DMS P≤0.05). Alternaria sp. de acuerdo con Lárraga y col. (2011), reportaron que son susceptibles al sulfato tribásico de cobre, al Azoxystrobyn® y al Mancozeb. Cladospirium herbarum de acuerdo con Guzmán (1997); son susceptibles al Benomyl. Aspergillus sp. de acuerdo con Guzmán, (1997) son susceptibles al Mancozeb y Benomyl.  Fusarium solani estos fitopatógenos, de acuerdo con Herrera y col. (2011), son intolerantes al Benomyl, Mancozeb, Tiabendazol y Diafenoconazol.

Figura 2.- Hongos identificados en cultivo in vitro de segmentos nodales de Guadua angustifolia Kunth.

Etapa 2.-  A partir del cuarto día después de la siembra se observó la aparición de microorganismos únicamente en T0 (100%c), mientras que hasta la 6ta semana de incubación se presentó en el T4 (20%b); no obstante, los tratamientos T1, T2, y T3 permanecieron asépticos (0%a). Nuestros resultados concuerdan con Tello (2003), quien reportó Cladosporium herbarum en explantes de Guadua logrando su eliminación mediante el uso de Benomyl. Así mismo, Herrera y col. (2011) y Larraga (2011), reportaron Alternaria sp in vitro, logrando su eliminación con Mancozeb. Pérez (2014) reportó el uso de Benomyl y Mancozeb contra Fusarium solani, Gonzales (2010) lo usó contra Aspergillus sp., lo anterior en explantes in vitro de Guadua.  Marulanda y col. (2005), para la inducción de yemas in vitro, establecieron chusquines de G. angustifolia bajo condiciones de vivero los cuales fueron sometidos a podas de rejuvenecimiento para estimular la producción de brotes y nuevas ramas, realizaron en esta fase de aplicaciones semanales con fungicidas Benlate y Vitavax (1 mg/l) y fertilizante foliar una vez por semana. En otras especies forestales como Eucaliptus grandis más del 50% de los hongos filamentosos que conformaban su microbiota fueron eliminados con la aplicación de fungicidas preventivos de contacto como Mancozeb (10gr/L) y oxicloruro de cobre (10gr/L) en combinación con fungicidas curativos de acción sistémica como el Benomyl (2gr/L) (Cruz et al. 2002).

 En conclusión, se recomienda la inmersión de explantes nodales en Captan y/o Mancozeb (4 g/L), 24horas, seguido de inmersión 20 min en hipoclorito de sodio (NaClO) al 6% y etanol 90%, +  3 enjuagues con ADE respectivamente.  Así como suplementar el medio de cultivo con Benomyl (2g/L) + Gentamicina (2ml/L). Se recomienda realizar subcultivos en medio fresco, antes de la 6ta semana de incubación, una vez que se ha vencido la barrera de contaminación. Actualmente, nuestro grupo de trabajo realiza estudios para evaluar el efecto organogénico de diferentes reguladores de crecimiento vegetal sobre explantes nodales de Guadua, enfocado hacia la propagación masiva de plantas sanas.