Introducción

La acuicultura es una industria en constante crecimiento, que enfrenta retos mayores y amenazas por las enfermedades. Entre las alternativas, el fortalecer el sistema de defensa de los peces, mediante el uso de inmunoestimulantes de fuentes naturales, es una estrategia eficaz, económica y sostenible. La levadura C. benthicum y la pulpa de ciruela C. edulis en la dieta de los peces mejoran la salud porque activan mecanismos de defensa a nivel celular y molecular (Reyes-Becerril et al., 2021; Machuca et al., 2024). Estas fuentes naturales son ricas en carbohidratos, algunos con propiedades inmunoestimulantes, los cuales podrían ser reconocidos por receptores del sistema inmune de peces (Reyes-Becerril et al., 2021;  2024).  Su uso en la acuicultura podría contribuir  al desarrollo de prácticas más sostenibles y saludables, reduciendo la dependencia de tratamientos químicos y antibióticos, y promoviendo un enfoque ecológico y económico. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la suplementación dietaría con C. benthicum y C. edulis en la tilapia del Nilo sobre la expresión de genes de receptores de reconocimiento de carbohidratos.

Materiales y métodos

Genes y oligonucleótidos:  Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes a los receptores clúster de diferenciación 209 (Cd209) y receptor de macrófagos con estructura colágena (Marco) se obtuvieron de la base de datos GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Las regiones de las proteínas codificadas por Cd209 y Marco, que reconocen carbohidratos, se localizaron utilizando las herramientas SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) y Prosite (https://prosite.expasy.org/). Finalmente, los pares de oligonucleótidos (primers) se diseñaron para los análisis de expresión de los genes en la tilapia empleando el servidor web Prime3 (https://primer3.ut.ee/).

Dietas: La cepa LR192 de C. benthicum (Colección del CIBNOR) se cultivó en medio nutritivo YPD (28 °C, 120 rpm, 48 h) y la biomasa se separó por centrifugación (4 °C, 4000 x g por 10 min). La pulpa de ciruela se obtuvo separando las cáscaras y semillas. Ambos se deshidrataron por liofilización (FreeZone 18, LABCONCO, Kansas City, MO, EE. UU.). Se formularon cuatro dietas suplementadas: Cb (0.5 %), Ce (0.5 %), una combinación (Cb 0.25 % + Ce 0.25 %), y una dieta control (0 %). Como base se utilizó un alimento comercial con 32 % de proteína (Nutripec Purina®, México), al que se añadieron los suplementos, más 1.5 % de aglutinante sal sódica de ácido algínico (Cat. 180947, Sigma, USA) y agua purificada. Finalmente, los pellets se elaboraron en un procesador de alimentos (Oster® Regency, USA) y se secaron a 50 °C (24 h).

Peces: Se utilizaron tilapias del Nilo  (peso promedio: 246 ± 44 g) en 12 tanques circulares (1000 L) con seis peces por tanque. Se  establecieron cuatro grupos según las dietas: control, Cb, Ce y Cb:Ce, con tres tanques por cada grupo. Los peces se alimentaron dos veces al día en base al 2 % de su peso corporal durante 28 días.

Muestreos: En los 14 y 28 días, las tilapias fueron anestesiadas con aceite de clavo (0.5 ml/L) y se eutanasiaron para recolectar muestras de 1 cm de intestino anterior que se colocaron en solución TRIzol (Invitrogen) para su preservación hasta su análisis.

Extracción de ARN y síntesis de ADNc: El ARN se extrajo triturando las muestras de intestino en la solución TRIzol, añadiendo cloroformo para separar las fases y luego precipitando el ARN con isopropanol. Para sintetizar ADNc a partir del ARN, se utilizó el proceso de transcripción reversa que sintetiza ADN complementario (ADNc) a partir de ARN con la ayuda de un oligonucleótido llamado oligodT18.

Análisis de la expresión de genes: Los análisis de expresión génica se realizaron mediante qPCR, técnica que mide la cantidad de ADNc amplificado (multiplicado). Los resultados se expresaron como un cambio en la cantidad de ADNc, ajustando cada muestra con respecto un gen control de expresión relativamente estable, en este caso, el gen del factor de elongación 1 alfa. De esta manera, el aumento o la disminución en la expresión de los genes cd209 y marco se evaluó en función del efecto de la dieta suplementada.

Resultados y discusión

El gen cd209 pertenece a la familia de receptores tipo lectina y presentó un dominio especializado en el reconocimiento de carbohidratos (CRD), que incluye los segmentos (motivos) QPN y WND, responsables específicos de la unión con calcio/carbohidratos, los cuales son conservados entre varias especies de peces (Fig. 1a), y muestran alta afinidad por carbohidratos compuestos por glucosa (Wang et al., 2020).

Figura 1. Genes cd209 y marco de la tilapia del Nilo. a) cd209: dominio transmembrana (azul), dominio de lectina de tipo C (rosa) y motivos conservados de unión QPN (negro; Q: glutamina, P: prolina, N: asparagina) y WND (gris; W: triptófano, N: asparagina, D: ácido aspártico). b) marco: dominio transmembrana (azul), dominio de colágeno (negro), receptor Scavenger  (verde) y motivo conservado de unión GRVEV (negro; G: glicina, R: arginina, V: valina, E: ácido glutámico, V: valina).

Después de 14 días, los peces alimentados con dietas suplementadas no mostraron diferencias en la expresión del gen cd209 en comparación con los de la dieta control, aunque sí se observó una tendencia de aumento en los peces alimentados con Cb y Cb:Ce (Fig. 2a). Esto podría estar relacionado al reconocimiento del β-glucano, carbohidrato presente en la levadura, conocido por activar el sistema inmune rápidamente a través de estos receptores y que, en el transcurso del tiempo la expresión disminuye por la activación de mecanismos regulatorios (Petit et al., 2019 Machuca et al., 2022) que probablemente redujeron la expresión del gen al día 28 (Fig. 2b).

El gen marco pertenece a la familia de receptores Scavenger o depuradores y se identificó un motivo GRVEV (Fig. 1b), especializado en la unión a moléculas asociadas a patógenos que juega un papel crucial en la activación de células (macrófagos) responsables de la destrucción de patógenos.

Figura 2. Expresión del gen clúster de diferenciación 209 (cd209) en tilapia del Nilo a 14 (a) y 28 días (b) de alimentación con dietas control y dietas suplementadas con Cystobasidium benthicum (Cb), Cyrtocarpa edulis (Ce) y su combinación 1:1 (Cb:Ce) al 0.5 %. Media ± error estándar, p  < 0.05).

Después de 14 días, los peces alimentados con las dietas no aumentaron la expresión el gen marco (Fig. 3a), pero a los 28 días los peces suplementados con la dieta Ce aumentaron la expresión de este gen en comparación con el grupo control (Fig. 3b). Un efecto similar se observó en el pez jurel (Seriola rivoliana) cuando se le suplementó una dieta con la pulpa de la ciruela del Mogote o cimarrón, sugiriendo que existen carbohidratos inmunoestimulantes  que inducen la expresión del gen marco (Reyes-Becerril et al., 2024).

Figura 3. Expresión del gen receptor de macrófagos con estructura colágena (marco) en tilapia del Nilo a 14 días (a) y 28 días (b) de alimentación con dietas control y dietas suplementadas con Cystobasidium benthicum (Cb), Cyrtocarpa edulis (Ce) y su combinación 1:1 (Cb:Ce) al 0.5 %. Media ± error estándar, p  < 0.05.

Conclusiones

Los resultados indican que la inclusión de la levadura C. benthicum y la pulpa de la ciruela del Mogote (C. edulis) en la dieta para tilapia del Nilo, activan la expresión de receptores de carbohidratos del sistema inmune