Introducción

La aparición de enfermedades en los cultivos acuícolas depende del desequilibrio entre el ambiente, el hospedero y el patógeno; la prevención es la mejor alternativa, donde se busca eliminar el patógeno del sistema de producción o evitar los efectos de la infección reduciendo la transmisión entre los individuos del estanque. Sin embargo, cuando la prevención falla, las medidas correctivas requieren del conocimiento sobre la dinámica de la infección presente. El principal problema que enfrenta el cultivo de camarón es la aparición de enfermedades. Una de las causas de mortalidad más agresivas es la enfermedad de las manchas blancas que causa pérdidas económicas millonarias en la industria a nivel mundial, por lo que es prioritario encontrar estrategias para disminuir estas pérdidas. La enfermedad de las manchas blancas en camarón parece ser una infección viral que aprovecha una situación de estrés para infectar camarones y se manifiesta con letargia, coloración rojiza, anorexia, nado en la superficie del agua y muerte en horas o en pocos días. La mortalidad puede alcanzar hasta el 100% de los organismos infectados (Lo & Kou 1998). Además de su virulencia, el WSSV se caracteriza por ser poco específico en cuanto a la capacidad de invadir y dañar diversos tejidos (Chang, Lo, Wang & Kou 1996) y tiene un amplio espectro de hospedadores, que pueden albergar al virus y actuar como reservorios (Mendoza-Cano et al. 2014). El agente causal del síndrome de la mancha blanca (WSSV) es un virus que mide entre 70-150 nm y con base en las características morfológicas y su estructura genómica, se ha definido como miembro de la familia Nimaviridae que comprende un solo género llamado Whispovirus (Van Hulten, Tsai, Lo, Kou & Vlak 2000). La única forma de prevenir la infección por WSSV es disminuir las posibilidades de transmisión entre los organismos cultivados en la misma granja o en granjas cercanas. Algunas hipótesis de potencial transmisión son: 1) que el virus se encuentre en organismos silvestres cercanos a las granjas y se introduzca en los estanques, 2) que esté en algún organismo, en la porción del plancton, que pueda actuar como portador, o 3) que se encuentre en los organismos que componen el fondo de los estanques y permanezca de un ciclo de cultivo a otro. En este trabajo se demostró la transmisibilidad de WSSV por plancton y se generó una metodología para el monitoreo y la vigilancia epidemiológica de la transmisión del virus en los cultivos de camarón.

Objetivos

Definir la participación del plancton en la transmisibilidad del WSSV e implementar una técnica para la detección del virus en el agua de cultivo.

Materiales y métodos

Se colocaron, en un estanque con infección activa por WSSV, jaulas de 1 m³ con malla de 300 µ donde no era posible la entrada de camarones del estanque. Para mantener la misma densidad de organismos que en el estanque, en cada jaula se colocaron 10 camarones de 8g, previamete analizados por PCR para asegurar la ausencia de WSSV. Se utilizaron seis jaulas, 3 colocadas en suspensión a 50 cm del fondo y 3 fijadas al fondo de tal manera que se tuviera contacto con el sedimento (figura 1). Se colocó un grupo de 10 organismos en un acuario conteniendo agua de un estanque sin presencia de WSSV como control. El 100% de los organismos de las jaulas y del control se analizaron diariamente, de manera individual. Se obtuvieron muestras de 0.2 ml de hemolinfa, con una jeringa de 1 mL conteniendo 400 µL de EDTA (10 mM) disuelto en solucion salina (450 mM) de acuerdo la metodología de Vargas-Albores y col. (1993).

Figura 1: Esquema que muestra la distribución de las jaulas en el bioensayo para definir si los organismos de la columna de agua (plancton) participan en la transmisión del WSSV.

La hemolinfa se centrifugó y se usaron las células recuperadas para el analisis de PCR. De manera simultanea, se tomaron muestras de agua dentro de cada jaula y fuera de ellas. Las muestras de agua se filtraron en malla de 100 micras y 20 ml del filtrado se pasaron a través de filtros con 0.45 micras de tamaño de poro para analizar la fracción más pequeña del plancton (entre 0.45 y 100 µ). Todos los filtros se fijaron en alcohol 96%, para su conservación. Los filtros fueron procesados para la extracción de ADN y se analizaron por PCR para buscar la presencia del WSSV. Todas las pruebas moleculares se realizaron en el laboratorio de la misma granja, reduciendo el tiempo de obtencion de resultados a 8 horas después de tomada la muestra. Las muestras de plancton positivas a WSSV se comprobaron por secuenciación de los fragmentos amplificados. Para la secuenciacón, las muestras se enviaron al laboratorio de la Universidad de Arizona, USA.

Resultados y Discusión

Durante una investigación realizada en una granja de camarón con presencia de mortalidad por WSSV, se analizó la posibilidad de que el plancton fuera la causa de la transmisión. Se encontró la presencia de este patógeno en el sedimento y en la fracción del plancton mayor a 100 µ. Los resultados demostraron que los camarones, que no estaban en contacto directo con otros camarones infectados, pueden adquirir el WSSV presumiblemente a través de los organismos del plancton y del bentos en periodos tan cortos como 24 horas después de la exposición (Figura 2).

Figura 2: Porcentaje de camarones infectados en las jaulas experimentales. A: durante la fase aguda de la infección en el estanque. B: Durante la fase de recuperación del mismo estanque.

Los resultados de PCR mostraron un 70-75% de infección en los camarones de las jaulas a las 24 h y 100% de infeccion a las 72 h post introducción, sin diferencias significativas (P<0.01) entre las jaulas que tenían contacto con el fondo de los estanques y las jaulas flotantes. Los controles experimentales, permanecieron negativos a WSSV al ser analizados por PCR durante el ensayo. El análisis de PCR del plancton dentro y fuera de las jaulas mostró la presencia del virus tanto enlas fracciones mayores a 100 micras como en las mas pequeñas (0.45 a 100 micras), asi mismo, se detectó que la fracción del zooplancton no solo manitene al WSSV de manera pasiva sino que puede replicarlo aumentando la carga viral en la transmisión. Después de la tercer semana de muestreo el WSSV pudo ser detectado en las muestras filtradas por 0.45 µ pero no en la fracción mayor de 100 µ, ni en los organismos de cultivo. Posterior a la cuarta semana de muestreo, sorpresivamente el virus no se encontró ni en las fracciones pequeñas del plancton (entre 0.45 micras y 100 micras), ni tampoco en la fracción mayor a 100 micras, ni en los camarones. Es importante señalar que la cantidad de plancton se disminuyó significativamente en el estanque asi como la densidad de camarones lo que permitió hipotetizar que la transmisibilidad del WSSV disminuyó de tal manera que los camarones sobrevivientes no se infectaron debido a la ausencia de plancton con virus. Sin embargo, debido a la necesidad de conocer si el virus se encontraba en tan baja concentración que no fuera posible detectarlo con las técnicas de muetreo usadas, pero que pudiera transmitirse a organismos sanos, se realizó un ensayo colocando nuevamente el sistema de jaulas con camarones sanos en el estanque . A los organismos introducidos se les tomaron muestras de hemolinfa diariamente durante 6 días, para detectar la presencia de WSSV. Ningun organismo de las jaulas ni de los controles presentraron signos de enfermedad y los analisis de PCR resultaron negativos a WSSV. Las muestras de plancton, positivas por PCR a WSSV mostraron un 100% de identidad con la secuencia reportada para WSSV (numero de acceso: AF332093.1).

Conclusiones

Los resultados obtenidos en este trabajo aportan evidencias de que la via de transmisión y dispersión de WSSV es a través de los microorganismos del plancton. En el desarrollo de este trabajo se generó una tecnología que permite analizar la presencia de WSSV en agua, filtrando a través de membranas de 0.45 micras, asi como la posibilidad de comprobar la infectividad del agua de cultivo de un estanque mediante el empleo de jaulas conteniendo camarones libres del virus, mediante la obtención de una muestra de hemolinfa, sin la necesidad de sacrificar los camarones analizados.