Introducción

A pesar de que el melón es comercializado mundialmente por su sabor y contenido nutricional, hay pérdidas de hasta el 50% de la producción mundial por enfermedades fúngicas tales como la pudrición del fruto por Fusarium spp, ya que esta enfermedad disminuye la calidad del fruto y su vida de anaquel (Rivas-García et al., 2018). Los fungicidas sintéticos son el tratamiento convencional; sin embargo, su mal uso ocasiona problemas de salud, contaminación y resistencia microbiana (Dukare et al., 2019). El control biológico con levaduras y bacterias mediante mecanismos de acción como: parasitismo, competencia por espacio y nutrientes, producción de enzimas líticas, compuestos volátiles, surfactantes e inducción de resistencia, entre otros, es una alternativa viable al tratamiento convencional (Kohl et al., 2019). Además, el polisacárido ulvan extraído de la macroalga Ulva spp. ha sido utilizado previamente como inductor de resistencia en plantas y en tratamiento conjunto con los agentes de control biológico puede incrementar la eficiencia del tratamiento propuesto (Chiquito-Contreras et al., 2019). Por lo anterior, es importante elucidar los mecanismos de acción involucrados en este tratamiento conjunto para optimizar su desempeño en contra de patógenos en los cultivos.

Objetivos

Evaluar los mecanismos como competencia por espacio y nutrientes, producción de enzimas líticas, inhibición por compuestos volátiles, producción de bio-surfactantes e inducción de resistencia de D. hansenii, S. rhizophila y ulvan como tratamiento conjunto o individual para el control de F. proliferatum en frutos de melón.

Materiales y Métodos

La morfología del hongo fitopatógeno se determinó por medio de claves taxonómicas descritas por Nelson et al. (1994).  Para la identificación molecular se amplificaron por PCR tres fragmentos de genes (ITS1-5.8s-ITS4, β-Tubulina, TEF-1α) del ADN del hongo fitopatógeno y sus secuencias se compararon con las secuencias de hongos almacenadas en la base de datos del GenBank del NCBI. Para seleccionar la levadura y bacteria con mejor actividad antifúngica in vitro, se realizó una prueba de antagonismo por cultivo dual en placa con microorganismos de la colección de cepas del Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR S. C.). Posteriormente, con la levadura (D. hansenii) y la bacteria (S. rhizophila) seleccionadas se realizaron pruebas de inhibición in vitro del crecimiento miceliar e inhibición de la germinación de esporas del fitopatógeno. Para determinar el efecto de ulvan tenía un efecto antimicrobiano, se inocularon a D. hansenii, S. rhizophila y F. proliferatum en medios líquidos y sólidos con ulvan a diferentes concentraciones. En la competencia por nutrientes se cuantificó glucosa (Kit Randox, 490 nm), fructosa (triptamida-HCl, 518 nm) y sacarosa (HCl-DNS, 570 nm) en medio suplementado con tejido de melón (Rivas-García et al., 2019). En los mecanismos de acción evaluados: la producción de compuestos volátiles (Raza et al., 2016) se determinó por cultivo dual de cajas selladas con parafilm; la producción de bio-surfactantes (Otsu et al., 2004) por sobrenadantes de medios líquidos inoculados con D. hansenii y S. rhizophila sobre membranas hidrófobas (parafilm); la producción de enzimas líticas (glucanasas, quitinasas y proteasas) (Hernández-Montiel et al., 2018) se evaluó por técnicas colorimétricas. Finalmente se evaluaron variables de inducción de resistencia (enzimas antioxidantes), parámetros de calidad del fruto (pérdida de peso, firmeza, solidos solubles totales, pH) y tiempos de inoculación (Wang et al., 2018). En todos los experimentos el diseño experimental fue completamente al azar con tres repeticiones por tratamiento y el experimento se realizó dos veces. Los datos fueron tratados mediante un análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de comparación múltiple de medias de Fisher (LSD) a un nivel de significancia del 5% (P≤0.05), con el programa estadístico Statistica v.10.0 (StatSoft, 2011).

Resultados y Discusión

Se aisló e identifico a F. proliferatum como agente causal de la pudrición de los frutos de melón enfermos colectados (Figura 1). Las secuencias obtenidas tuvieron un porcentaje de identidad del 100% con secuencias de cepas de F. proliferatum del NCBI (claves de acceso: KT218534.1; KP964908.1; KT803067.1). De la selección realizada por antagonismo en cultivo dual se tomaron a una cepa de D. hansenii y una de S. rhizophila por tener mayor actividad antagónica in vitro.

Figura 1. Identificación de Fusarium proliferatum. Características morfológicas macroscópicas de tres de las cepas aisladas (a, b, c) en PDA a 28 °C por 7 días. Principales estructuras microscópicas en microscopio óptico (d), macroconidio y en microscopia electrónica de barrido (MEB) [MC], microconidio [MI], micelio [M] y clamidosporas [C].

En la prueba de inhibición de la germinación de esporas D. hansenii y S. rhizophila tuvieron un 52% y 78% de inhibición respectivamente. En comparación con el tratamiento control, ulvan no inhibió el crecimiento en medio líquido y solido de D. hansenii, S. rhizophila y F. proliferatum. En la cuantificación de glucosa, sacarosa y fructosa para determinar la competencia por nutrientes, el medio donde se inocularon en conjunto a D. hansenii y S. rhizophila tuvo la menor concentración de carbohidratos y el mayor porcentaje de inhibición de la germinación de F. proliferatum. Al evaluar los posibles mecanismos de acción de D. hansenii y S. rhizophila, el tratamiento conjunto mostró la mayor producción de glucanasa (120 U mL^-1), quitinasa (6000 U mL^-1) y proteasa 2100 µg mL^-1) respectivamente. Ambos microorganismos inhibieron el crecimiento de F. proliferatum en un 48 y 37% por producción de compuestos volátiles y también produjeron compuestos biosurfactantes (Figura 2).

Figura 2. Actividad biosurfactante por D. hansenii y S. rhizophila en cascara de melón. Gotas de: a) Sobrenadante de D. hansenii cultivado por 7 días, b) Sobrenadante de S. rhizophila cultivado por 7 días. Como tratamientos control: c) CPD, d) CST y e) agua destilada estéril. NOTA: La capacidad surfactante permite la extensión de la gota sobre el exocarpio de melón (membrana hidrófoba).

El tratamiento individual y conjunto de D. hansenii, S. rhizophila y ulvan incrementaron la actividad de enzimas antioxidantes (superoxido dismutasa, catalasa, peroxidasa y fenil alanina amonio liasa). En comparación con el tratamiento Control, las variables de calidad de los frutos mostraron que se retrasó la maduración, con lo cual se incrementó la vida de anaquel de los frutos. En los tiempos de inoculación, todos los tratamientos fueron eficientes para inhibir la pudrición del melón de manera preventiva, es decir, cuando se aplicaron antes o en conjunto con el fitopatógeno F. proliferatum no se presentó ninguna enfermedad (Figura 3).

Figura 3. Tiempos de inoculación. Frutos de melón inoculados con A) D. hansenii + S. rhizophila + ulvan, 24 h antes de la inoculación del patógeno; B) Tratamiento control (F. proliferatum).

Conclusiones

F. proliferatum es el agente causal de la pudrición de frutos de melón, lo cual fue reportado por primera vez. D. hansenii, S. rhizophila y ulvan en tratamiento individual o conjunto son una alternativa para el control de la enfermedad. Sin embargo, su eficiencia es condicionada a un tratamiento preventivo. D. hansenii y S. rhizophila inhiben la proliferación de F. proliferatum por mecanismos como: parasitismo directo, competencia por nutrientes, producción de enzimas líticas, biosurfactantes y compuestos volátiles.